擴增子、巨集基因組測序問題集錦
原文**諾禾致源，點我閱讀原文。作者整理的非常好，值得學習。但本人又結合自己經驗進行了修改，並對每個問題例舉了例項和新增自己的理解(個人經驗部分)。
微生物，是地球上最古老的生命形式之一，它們雖然微小，卻無處不在。隨著高通量測序技術的發展，測序成本逐步降低，測序通量飛速提高，如今我們可以用更低的成本，對微生物進行更深入和更廣泛的研究。在微生物群落多樣性研究中，目前主要的技術包括擴增子測序和巨集基因組測序。今天楊萍給大家總結了10個擴增子和巨集基因組測序中常見的問題，希望其中恰好也有您想要問的問題哦~
老師在實驗室多採用nanodrop對dna濃度進行檢測，而在公司我們會結合qubit、nanodrop、瓊脂糖電泳三種方法檢測dna樣品的質量；
由於不同檢測方法的原理不同，所以檢測出的結果也會存在一定的差異。其中，nanodrop檢測法是基於紫外分光光度原理進行檢測，由於dna樣品中可能含有部分雜質，因此會造成結果虛高的現象；qubit檢測法則是基於螢光標記的原理進行檢測，結果會更準確；
當兩種檢測方法的結果出現差異時，我們以qubit檢測結果為準。
個人經驗：我用ctab法提取的小麥總dna， nanodrop檢測濃度大於1000 ng/ul，結果公司返回的檢測報告只有100 ng/ul，差別可達10倍。可能是植物多醣含量高，dna純度比較難保證。
在計算微生物群落樣品之間的距離時，加權是考慮到樣品中otus的相對豐度資訊，而非加權則沒有考慮物種的相對豐度資訊；
如果老師研究的生物學問題與物種的相對豐度資訊密切相關，使用加權演算法的結果展示可能更為符合；如果研究的生物問題與豐度關係不密切，或者各組的區分與低豐度的otus更為密切，則使用非加權的結果可能更為合適。
個人經驗：我們組研究的一般基因型等差別對微生物組的影響，權重是非常重要的，非加權(unweighted unifrac)的結果亂成一團，完全不適合；即使是加權的(weight unifrac)解釋也不好，感覺它們比較適合區分差別較大的不同生態位(niche)。我們用bray-curtis物種距離一般會有更好的解釋。
對於組的otu計數，採用的是取並集的方式（當該組的重複樣品中只要有乙個樣品存在該otu，那麼就認為該組內存在該otu，若所有重複樣品中都不存在該otu，即認為該組內不存在該otu）。
由於這三種統計分析方法所使用的統計檢驗的方法有所不同，因此得出的結果也會存在差異。其中，t-test使用的是t檢驗的方法，metastat會根據樣本情況自動調整統計的方法（秩和檢驗或fisher檢驗），而lefse則使用了秩和檢驗和線性判別分析（lda），這3種統計分析方法篩選結果均是可信的，老師可以根據自己的研究背景選擇最為符合的分析結果。
生物學重複通常建議5個以上，至少3個。對於重複樣品間存在較大差異的個別樣本，一般建議：
1. 從樣品的準備過程進行分析，生物學重複的樣品，除了和設定的分組條件有關外，可能還受到很多其他因素的影響，進而造成分析結果出現差異；
2. 對於出現顯著離群的個別樣本，推測可能為樣本自身的原因（如在取樣、保藏、提取、擴增過程中樣本出現了問題等），建議剔除該樣本後，再進行分析。
個人經驗：偏離較大的個別樣品，對整體的統計是影響不大的，如果不是明顯人為原因的錯誤，不建議原始資料隨便刪除此樣品。如果出現多個樣品出現異常，比如分為差別很大的兩類，要檢查操作中是與有影響的步驟，如種子混雜，分批取材、提取和擴增是否使用不同方法或試劑、barcode或index是否有偏好，建庫和測序是否同批等，找不到原因可再完全重複實驗驗證，確保實驗結果準確是最重要的。
巨集基因組組裝的效果主要跟以下幾個因素有關：樣本的測序資料量，物種的多樣性，物種豐度分布不均勻等，這些因素都會造成巨集基因組組裝比細菌等單物種的組裝更加困難，這也是目前巨集基因組研究中有待突破的重點。
兩者的分析方法存在較大差異：16s是先擴增後測序，而且不同物種dna的擴增倍數也不一致；在巨集基因組dna測序中，測序深度可能不是十分充分，並且巨集基因組分析得到的相對物種豐度的差異與dna提取以及測序的方法都密切相關；
兩者採用的物種注釋方法及資料庫都存在著一定差別：16s採用的是將16s rdna與greengene（或silva）資料庫進行比對注釋，只能注釋到細菌；而巨集基因組則是將**得到的基因與nr資料庫比對從而進行注釋，巨集基因組注釋得到的物種資訊更為全面，不僅包括細菌，還包括真菌、古菌以及病毒等
此外，16s擴增子和巨集基因組分析得到的注釋結果也會存在一定的相似點，比如在門水平上相對豐度排名靠前的物種的類別會出現相似等情況；
綜上所述，兩者的分析方法本身存在一定的差異，是導致16s擴增子和巨集基因組分析得到的注釋結果存在差別的主要原因，但同時兩者也有一定的相似之處。
個人經驗例項：兩者在細菌有多大差別?下面舉乙個我同學海哥的分析例項，對某樣品同時進行16s和metagenome，其中展示了細菌中豐度大於1%的菌屬種類，16s有15個屬，metagenome有14個屬，兩者共有只有3個屬，用黃色高亮顯示。
個人感覺差異原因主要來自測序目標、技術方法、分析軟體及資料庫均不同。因為很多文章在taxonomy水平更多使用16s的結果，而功能注釋keeg/cog則使用metagenome的結果。
不同樣本中高丰度物種的差異很大，如果把所有樣本都混合在一起進行組裝，將會大大增加資料的複雜度，組裝效果可能會更差。
1）由於受到測序深度及測序成本的影響，在現在的巨集基因組文章中，測序資料量一般選擇6g，可以測出樣品中絕大多數的微生物，但是對於一些低豐度的物種，因為測序深度的原因，確實很有可能會組裝不出來；
2）在巨集基因組分析中，也一般多關注的是較高丰度物種的組成情況，如果要對低豐度物種進行特殊分析，一般需要加大測序資料量，或者在前期提取過程中經過一些特殊的處理，盡可能的富集出多的低豐度物種，再進行測序分析。
個人經驗：6g資料只適合簡單系統，如人類腸道等，對於複雜系列，如土壤，致使測序幾十到幾百g，也可能也會深度不足。
隨著人們對抗性基因相關研究的廣泛關注，我們巨集基因組的標準分析中推出了抗性基因的相關分析。並且，由於自2023年ardb資料庫再無更新，因此我們目前所用的抗性基因資料庫為card資料庫。
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