四代 dna 測序技術簡述
姚亭秀 （北京市第八十中學 北京 100102）
摘要
dna 測序技術是現代分子生物學研究中最常用的技術，極大推動了生物學的發展。從 20世紀 70 年代至今，dna 測序技術已歷經4代。 簡介被稱為 dna 測序始祖的第 1 代 測序技術、邊合成邊測序的第 2 代測序技術、不依賴於 pcr 擴增的第 3 代測序技術，以及處於 研發中的第 4 代測序技術。
第 1 代測序技術 第 2 代測序技術 第 3 代測序技術 第 4 代測序技術
中國圖書分類號：q81 文獻標識碼：a
自 1953 年 j. d. watson 和 p. h. c. crick 發現 dna 雙螺旋結構之後，dna 測序技術隨著科學技術的進步迅猛發展，目前已成為現代分子生物學研 究中最常用的技術之一。該技術從2023年起至今，歷經了第 1 代至第 4 代的發展。 本文對一些主要測 序技術的原理，核心步驟及優、缺點進行簡介。
1 第 1 代測序技術
第 1 代測序技術誕生於 1977 年,分別是 f. sanger 和 a. r. coulson 發明的 dna 雙脫氧核苷酸末 端終止測序法，以及 a. m. maxam 和 w. gilbert 發 明的化學降解法。在上述 2 種方法的基礎上，後來又 分別誕生了螢光自動測序技術和雜交測序技術等。
1.1 dna 雙脫氧核苷酸末端終止測序法/sanger 法
該技術原理為： 利用雙脫氧核苷三磷酸（ddntp） 比脫氧核醣核苷三磷酸（dntp）少 3′－oh，因此不能 在 dna 合成過程形成磷酸二酯鍵，使 dna 合成反 應中斷，進而測得 dna 序列。 因該技術的主要發明 人為 f. sanger，故該測序法又叫 sanger 法。
該方法的核心步驟為：
1）將含有待測單鏈片段 的 pcr 反應液中分別加入一種含放射性標記的雙 脫氧核苷三磷酸，完成 pcr 反應；
2）分別收 集、純 化反應產物；
3）對 pcr 產物進行聚丙烯醯胺凝膠 電泳；
4）對電泳結果進行放射自顯影，並判斷待測 dna 序列。 判斷機理：每個 pcr 反應體系都含有 一種被放射性同位素標記的 ddntp， 其會遵循鹼 基互補配對原則與模板鏈的含氮鹼基進行配對， 一旦其摻入新合成鏈的末端，該鏈就停止延長。因 此，每管反應體系中會合成以各自 ddntp 為 3′端 的一系列長度不等的核酸片段。pcr 反應終止後， 對 4 管反應產物進行凝膠電泳， 會分離出長度不同的核酸片段，長度相鄰的片段相差 1 個鹼基，再 經放射自顯影後，根 據 片 段 3′端的雙脫氧核苷依 次讀取鹼基序列，從而獲得 dna 的鹼基序列。 該測序技術優點為所測鹼基序列長、 穩定性 好、可 靠 性 高；缺點是難以自動化，不 能 滿 足 大 規 模測序的要求［1］ 。
1.2 化學降解法化學
降解法 由 a. m. maxam 和 w. gilbert 於 1977 年建立， 需對待測dna分子進行化學降解。
該方法的核心步驟為：
1）利用 限制性核酸內切酶將 dna 樣品切斷，**大小介 於 10~200 bp 的片段，組建為測序文庫；
2）利用鹼 性磷酸化酶和多核苷酸磷酸激酶對待測 dna 分 子的 5′p 進行放射性標記；
3）通過物理、化學等方 法將 待 測 dna 片段 變 為 單 鏈；
4）對待 測 dna 片 段的鹼基進行不同修飾後，將上述樣品分為 4 組， 利用能識別某一種或 某一類鹼基的酶 （見 表 1 ） 對 dna 分子進行切割，從而產生末端鹼基特異但 長度不同的放射性標記 dna 片段集群；
5）對 4 組 樣品進行聚丙烯醯胺凝膠電泳和放射自顯影，並 進一步判斷待測 dna 序列。
判斷機理：
聚丙烯醯胺凝膠電泳可將長度只相差 1 個核苷酸的單鏈 dna 分子 分 離 開，而 5 種不同的化學試劑可使目 的 dna 分子上特異性的鹼基體系斷裂，由於斷裂 後的 dna 片段長度與其在原 dna 分子 上 的 位 置 有關，所以反向於電泳順序即為待測 dna 鹼基序列。
值得注意的是：如果 g＋a **現 1 條帶，就看 g 列中是否有同樣大小的條帶 ， 若 有 即 為 g 鹼 基，若無則為 a 鹼基；
同理，如果 c＋t **現 1 條 帶，就看 c 列中是否有同樣大小的條帶 ，若有 即 為 c 鹼基，若無則為 t 鹼基。
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