三代組裝使用Canu對三代測序進行基因組組裝

canu是celera的繼任者，能用於組裝pacbio和nanopore兩家公司得到的測序結果。

canu分為三個步驟，糾錯，修整和組裝，每一步都差不多是如下幾個步驟：

這三步可以分開執行，既可以用canu糾錯後結果作為其他組裝軟體的輸入，也可以將其他軟體的糾錯結果作為canu的輸入，因此下面分別執行這三步,並介紹重要的引數。

幾個全域性引數：genomesize設定預估的基因組大小，這用於讓canu估計測序深度； maxthreads設定執行的最大執行緒數；rawerrorrate用來設定兩個未糾錯read之間最大期望差異鹼基數；correctederrorrate則是設定糾錯後read之間最大期望差異鹼基數，這個引數需要在組裝時多次調整；minreadlength表示只使用大於閾值的序列，minoverlaplength表示overlap的最小長度。提高minreadlength可以提高執行速度，增加minoverlaplength可以降低假陽性的overlap。

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## pacbio sequal wget -c -q ## minion wget -c -q # illuminia miseq wget -c -q wget -c -q

# build index for convert ~/opt/biosoft/smrtlink/smrtcmds/bin/pbindex pb.bam & # convert bam to fasta ~/opt/biosoft/smrtlink/smrtcmds/bin/bam2fasta -o pb pb.bam &

第一步：糾錯。三代測序本身錯誤率高，使得原始資料充滿了噪音。這一步就是通過序列之間的相互比較糾錯得到高可信度的鹼基。主要調整兩個引數

canu -correct \
-p ath -d pb_ath \
threads=10 gnuplottested=true\
genomesize=120m minreadlength=2000 minoverlaplength=500\
coroutcoverage=120 cormincoverage=2 \
-pacbio-raw pb.fasta.gz

可以將上述命令儲存到shell指令碼中進行執行,nohup bash run_canu.sh 2> correct.log &.

注: 有些伺服器沒有安裝gnuplot, gnuplottested=true 可以跳過檢查。

第二步：修整。這一步的目的是為了獲取更高質量的序列，移除可疑區域（如殘留的smrtbell接頭).

canu -trim \
-p ath -d pb_ath
maxthreads=20 gnuplottested=true\
genomesize=120m minreadlength=2000 minoverlaplength=500\
-pacbio-corrected ath/pb_ath.correctedreads.fasta.gz

第三步: 組裝。在前兩步獲得高質量的序列後，就可以正式進行組裝. 這一步主要調整的就是糾錯後的序列的錯誤率， correctederrorrate，它會影響utgovlerrorrate。這一步可以嘗試多個引數，因為速度比較塊。

# error rate 0.035 canu -assemble \ -p ath -d ath-erate-0.035 \ maxthreads=20 gnuplottested=true \ genomesize=120m\ correctederrorrate=0.035 \ -pacbio-corrected atg/pb_ath.trimmedreads.fasta.gz # error rate 0.050 canu -assemble \ -p ath -d ath-erate-0.050 \ maxthreads=20 gnuplottested=true \ genomesize=120m\ correctederrorrate=0.050 \ -pacbio-corrected atg/pb_ath.trimmedreads.fasta.gz

最後輸出檔案下的ath.contigs.fasta就是結果檔案。

對於高雜合物種的組裝，canu建議是用batoptions=-dg 3 -db 3 -dr 1 -ca 500 -cp 50引數盡量分出兩套單倍型，然後對基因組去冗餘。

batoptions表示傳遞後續的引數給組裝軟體bogart,-dg 3 -db3降低自動確定閾值時的錯誤率離差(deviation)，從而更好的分開單倍型。-dr 1 -ca 500 -cp 50會影響錯誤組裝的拆分，對於乙個模稜兩可的contig，如果至少另一條可選路徑的overlap長度至少時500bp，或者說另一條可選路徑時在長度上和當前最佳路徑存在50%的差異，那麼就將contig進行拆分。

關於雜合物種組裝的討論，參考

如果你的伺服器執行緒數很多，你在普通的機械硬碟上執行組裝，而且你的系統還是centos，那麼你需要調整乙個引數，避免其中一步的io嚴重影響伺服器效能。

canu通過兩個策略進行並行，bucketizing (『ovb』任務) 和 sorting (『ovs』任務)。 bucketizing會從1-overlap讀取輸出的overlap，將他們複製乙份作為中間檔案。sorting一步將這些檔案載入到記憶體中進行排序然後寫出到硬碟上。如果你的overlap輸出特別多，那麼該步驟將會瞬間擠爆的你的io.

為了避免悲劇發生，請增加如下引數:ovsmemory=16g ovbconcurrency=15 ovsconcurrency=15，也就是降低這兩步同時投遞的任務數，緩解io壓力。

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