macs2是peak calling最常用的工具。
這是macs2的主要功能，因為macs2的目的就是找peak，其他功能都是可有可無，唯獨callpeak不可取代。最簡單的用法就是
# 常規的peak calling
macs2 callpeak -t chip.bam -c control.bam -f bam -g hs -n test -b -q 0.01
# 較寬的peak calling
macs2 callpeak -t chip.bam -c control.bam --broad -g hs --broad-cutoff 0.1
基因組可比對區域大小
-q： q值(最小的fdr)的閾值，預設0.05。可以根據結果進行修正。q值是p值經benjamini–hochberg–yekutieli修正後的值。
一般常規是夠用的，但是如果你需要看那些更加寬的peak，可以按照官方的建議使用如下引數
上面的基本引數可以用在最初的分析。根據基本的分析結果，可以有選擇地使用下面的引數符合特定專案的需求。
比較基礎的引數:
和macs模型構建相關的引數。正如macs的名字所示, model-based analysis of chip-seq, 它需要先建立模型然後分析。那麼問題來了，建立什麼模型？模型的目的是什麼？這裡的模型指的是雙峰模型，建立雙模模型的目的是為了更好的將原始reads朝3'偏移，更好的表示蛋白和dna的作用位置。這裡還要多問一句為什麼要偏倚。
這就需要從實驗建庫說起。chip-seq目標是找到蛋白和dna的作用位置，所以先要讓蛋白和dna進行交聯，之後用超聲打碎，再用抗體把與蛋白結合的dna收集起來測序。在macs發表的2023年，那個時候的測序大多都以單端50bp為主，而超聲破碎的片段肯定大於50 bp（這可以通過電泳圖來了解），也就是說最開始的se50資料比對到參考基因組之後，得到的峰圖並沒有真實反映出原來的文庫情況。但由於比對到基因組正負鏈的概率是相似的，那麼就會形成兩個峰（如下圖），為了更好的還原出最來的文庫片段，就先建立了雙峰模型，以兩峰距離d的一半作為偏倚長度。
如果你的資料是se50或者se100，為了更準確地找peak，你需要建立雙峰模型，你可能要調整--bw,--mfold,--fix-bimodal,--shift,--extsize。 但是對於雙端測序而言，它本身測的就是文庫的兩端，因此建立模型沒有必要，偏倚也沒有必要，你只需要設定引數--nomodel。
左：macs找到的d；右：fkhr motif驗證
-m/--mfold: 構建雙峰模型時使用，預設是[5,50]，表示選擇那些倍數變化在5~10之間的富集區域。如果找不到100個區域構建模型，並且你還設定了--fix-bimodal時，它就會用--extsize引數繼續分析
--nolambda： 設定這個引數就意味著不用macs推薦的動態lambda，而是使用背景lambda作為local lambda，也就是不考慮染色質結構等造成的區域性偏誤。
--slocal, --llocal: 這兩個引數也是macs用來計算動態lambda會用到，分別計算1kb內lambda(slocal)和10kb的lambda(llocal)，目標是處理類似於開放染色質區域的效應。注，如果這兩個引數太小，輸入資料中的尖峰(sharp spike)就可能乾掉顯著性的peak。
公式謹慎使用的引數：
callpeak會得到如下檔案：
bdgcmp使用*_treat_pileup.bdg和*_control_lambda.bdg計算得分軌(score track)
bdgpeakcall使用*_treat_pvalue.bdg或bdgcmp得到的結果或beggrap**件進行peak calling.bdgbroadcall差不多也是這樣子。
bdgdiff能用來分析4個bedgrap**件,得到treatment1 vs control1, treatment2 vs control2, treatment1 vs control2, treament2 vs control1的得分。
filterdup：過濾重複，結果是bed檔案
predictd：從比對檔案中估計文庫大小或d
randsample： 隨機抽樣
pileup：以給延伸大小去堆積(pileup)比對得到的reads。這一步不會有去重和測序深度標準化，你需要預先做這些工作。
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