差異分析的步驟：
1）比對；2）
read count
計算；3
） read count
的歸一化； 4
）差異表達分析；
背景知識：
1）比對：
普通比對：
bwa，
soap
開大gap
比對：tophat
（bowtie2）；2
） read count(
多重比對的問題）：
丟棄平均分配
利用unique region
估計並重新分配
表達量計算的本質
目標基因表達量相對
參照系表達量
的數值。
參照的本質：（ 1
）假設樣本間參照的訊號值應該是相同的；（ 2
）將樣本間參照的觀測值校正到同一水平；（ 3
）從參照的數值，校正並推算出其他觀測量的值。
例如：qpcr:
目標基因表達量（迴圈數）相對看家基因表達量（迴圈數）；
rna-seq:
目標基因的表達量（測序
reads
數），相對樣本
rna總表達量（總測序量的
reads
數），這是最常用的標準。
歸一化的原因及處理原則：
1）基因長度
2）測序量
3）樣本特異性（例如，細胞
mrna
總量，汙染等）前兩者使用普通的
rpkm
演算法就可以良好解決，關鍵是第三個問題，涉及到不同的演算法處理。
rna-seq
歸一化演算法的意義：
基因表達量歸一化
：在高通量測序過程中，樣品間在
資料總量、基因長度、基因數目、高表達基因分布甚至同乙個基因的不同轉錄本分布
上存在差別。因此不能直接比較表達量，必須將資料進行歸一化處理。
rna-seq
差異表達分析的一般原則
1）不同樣品的基因總表達量相似
2）上調差異表達與下調差異表達整體數量相似（上下調差異平衡）
3）在兩組樣品中不受處理效應影響的基因， 表達量應該是相近的（差異不顯著）。
4）看家基因可作為表達量評價依據（ 待定）
不同的演算法比較：
以什麼數值來衡量表達量：
rpkm
、fpkm
、tpm
以什麼作為參照標準：
tmm（
edger
軟體）、
de seq矯正
本質：1）以
reads
數為計算單位；
2）對基因長度（基因間的比較）和總資料量（樣本間的比較）做矯正；
rpkm的弊端
1）由於可變剪下，同一基因有效轉錄區域長度未必相同（這個一般情況下可以不考慮，了解一下：
cufflinks
軟體考慮了這個問題）優化策略：外顯子或轉錄本水平的表達量分析。
2） 使用
reads
數計算基因表達量有輕微誤差（這裡暫不展開，主要了解一下定義）優化策略：
fpkm
或 tpm3）
mrna
的總量未必相等。
rpkm
的優化：
fpkm
f = fragment
，即測序片段數量。這些片段都
是從完整的
cdna
打碎而來的；
本質：以文庫中的片段數量為計算單位在
paired-end
測序中，乙個
fragment
就是兩條
pe reads
構成的片段。由於是
pe比對，理論上比
se比對更可靠。
rpkm
的優化：
tpmt = transcripts
本質：以轉錄本的條數為計算單位。使用轉錄本的條數（或者說：轉錄本的測序深度），代替
reads
數，在一定條件下定量更準，尤其樣本間表達基因總數差異很大的時候（例如，對照樣本有
1萬個基因表達，另外處理組僅有
4000
個基因表達）。
mrna
總量未必相等
mrna
總量不等
——細胞本身不同
例如：活躍組織
vs休眠的組織；癌細胞
vs正常細胞
mrna
總量不等
——汙染
例如：核醣體汙染外源
rna汙染
解決方法
——不同演算法比較
其中歸一化演算法介紹：1）
total count（tc
）：總reads
數矯正2
）upper quartile（uq
）：上四分之一分位數（總
reads）矯正
3）median
（med
）；中位數（總
reads
數）矯正4）
quantile (q)
：基因晶元軟體
limma
中的校正演算法；5）
rpkm
：總reads
數，但引入了基因長度
6）幾何平均數：
deseq
軟體中的演算法；7）
tmm：
edger
軟體中的演算法；8）
rpkm邏輯1
：不同位置數值的穩定性不同
四分位數
quartile:
將資料按從小到大排列，並分成四等分，這樣得到
3個分割點，第乙個分割點叫做
lowerquartile
，第二個叫
media
，第三個叫
upper quartile
很顯然，極大值具有極大不穩定性，而且可能會顯著影
響總體之和（假設，我們之中有個馬雲，我們的總收入
有什麼變化？）
所以，upper quartile
和median
的數值，比總表達量之
和更加穩定，更適合作為參照。邏輯2
：表達量居中的基因的表達量值，其數值應該是相似的。
deseq
與edger
，預設情況下都使用這一的邏輯校正。（
deseq and edger bioconductor packages
）
deseq：
異常高表達的基因，會顯著影響細胞中的總
mrna
的數量。類似的，如果樣本中受到不同程度的外源
rna，如病毒、真菌等的汙染，也會顯著影響樣本總
mrna
數，導致
rpmk
值的誤差。
對於這樣的問題，
deseq
嘗試對資料進行矯正（矯正因子），使表達量處於中間位置的基因表達量應該是基本相同的（即使用表達量處於中間的基因表達量值作為參照，而減少高表達基因的作用）。
deseq：
校正因子
=樣本表達中位數
/所有樣本表達量中位數：
回答了乙個關鍵的問題：
deseq
不同差異比較組間，計算得到的表達量值不同。因
為樣本在變化，「所有樣本表達量的中位數」也在變動。
rpkm
：總表達量為參照
deseq
：中位數為參照
tmm（edger）：與
deseq
類似，在去除高表達基因和差異最大的基因後，
tmm也是要找到乙個加權係數，使剩餘的基因在被矯正後差異倍數可能小。
tmm的加權係數是基於兩兩樣本比較後推算獲得的（也就是兩組樣本的比較，將產生與這次比較相關的加權係數）。然後將所有基因除以這個加權係數，從而保證
大部分表達量居中的基因
表達量最相似。
不同rna-seq
表達量歸一化演算法的區別
deseq
類的校正演算法：
理論上更加穩定；
但不同批次的比較會得到不同的表達量值，不利於進行多處理組
/批次資料的統一分析（例如，趨勢分析、共表達分析）
校正會掩蓋一些問題（例如：樣本汙染）
rpkm
類的演算法：
容易受異常高表達基因、外源汙染等的干擾；
但也更容易從結果的異常中，發現潛在問題；
得到的表達量值是恆定的，多處理組
/批次的資料可以合併分析。折中的方法：使用
rpkm
類的演算法，但需要人工檢查資料是否
異常。備註：
deseq
軟體也可以關閉校正的功能。
實際經驗總結
總之：從多方面考慮，
rpkm
類演算法，如果合理使用，依然是最優的。具體問題具體分析：在遇到問題的時候，找到問題的**，從而給出解決方案（沒有完美的流程，只有最佳解決方案）
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